תאור הבדיקה - חיפוש מוטציות בגן RET

ייעוד הבדיקה למחלה / מחלות הבאות:
סרטן בלוטת המגן מסוג MTC: Medullary Thyroid Carcinoma
התסמונת האנדוקרינית המכונה MEN2: Multiple Endocrine Neoplasia Type 2
ומחלת חסימת המעיים על שם Hirschsprung HSCR:

מידע כללי על הבדיקה:

• עקרון הבדיקה: בדיקת DNA המופק מתאי דם לבנים לגילוי פגמים תורשתיים (מוטציה) בגן RET
• ייחודיות/חדשנות הבדיקה על פני בדיקות אחרות: הבדיקה מגלה נטייה תורשתית לפתח גידולים אנדוקריניים ממאירים כגון סרטן מסוג MTC בבלוטת המגן, גידול מסוג פיוכרומציטומה ביותרת הכליה, וחסימת מעיים על רקע מחלת ”הירשפרונג”. גילוי מוקדם של נטייה זו מאפשרת נקיטת אמצעים למניעת התפתחות המחלה והתפשטותה. מציאת המוטציה האחראית למחלה מאפשרת גם בדיקת קרובי משפחה אשר בקשר דם עם נשא המוטציה. במשפחה בה המוטציה הגורמת למחלה ידועה, אותם בני משפחה אשר לא ירשו את המוטציה משוחררים מבדיקות מעקב תכופות ומיגעות.
• מגבלות הבדיקה: הבדיקה מומלצת לחולים עם גידול בלוטת המגן מסוג MTC, חולים עם תסמונת האנדוקרינית המכונה MEN 2 וחולים עם חסימת מעיים על רקע מחלת ”הירשפרונג”. הבדיקה מלווה בייעוץ גנטי. הבדיקה מגלה מעל 90% של המקרים עם תסמונת MEN 2 ו- MTC תורשתי וכ- 20% של מקרי מחלת ”הישפרונג” תורשתי.
• מידע נוסף על הבדיקה ובדיקות משויכות: בביה”ח קיימים שירותים נוספים לאבחון, טיפול ומעקב אחר החולים הנ”ל במחלקות לאנדוקרינילוגיה של מבוגרים וילדים, מחלקת אף-אוזן וגרון, מחלקה אונקולוגית והמחלקות לגסטרואנטרולוגיה של מבוגרים וילדים.

פרטים טכניים:

• סוג הדגימה (דם, שתן וכו'): דם
• הוראות לקיחת הדגימה: כ 10 מ”ל דם ורידי טרי (3-4 מבחנות לספירת דם).
• תדירות הביצוע: חד פעמי
• פרק הזמן לביצוע הבדיקה: כארבעה שבועות
  

סיפו-RET: בדיקות גנטיות בתסמונת MEN2

מאמר זה מבוסס על סקירות [1-3] ומאמרים עדכניים [4-8] ועל ניסיוננו בביצוע בדיקות מוטציות בגן [RET9]. מטרת המאמר היא להציג את הבסיס המדעי והראיות הקליניות לשימושיות הבדיקות הנ"ל באבחון, בטיפול ובמעקב של חולים עם תסמונת MEN2.

הבסיס המולקולרי של תסמונת MEN2

תסמונת MEN2 (או: Multiple Endocrine Neoplasia Type 2) מאופיינת ע"י צבר גידולים אנדוקריניים ותופעות נוספות אצל אותו פרט או אצל פרטים שונים באותה משפחה. מקובל לחלק את התסמונת לשלש תת-קבוצות:

1. FMTC (שהוא: Familial Medullary Thyroid Carcinoma), כלומר: MTC משפחתי.
2. MEN2A
3. MEN2B

ב- FMTC גידול מסוג MTC הוא הביטוי היחיד של התסמונת. ב- MEN2A, בנוסף ל-MTC מופיעה פיוכרומציטומה (PHEO) בכ- 50% מהמקרים והיפר-פראתירוידיזם  (HPT) בכ- 25-30% מהמקרים. תופעות נדירות נוספות הן מפגע עורי מסוג cutaneous lichen amyloidosis , התעבות עצב הראיה ומחלת הירשפרונג (Hischsprung's Disease-HSCR)  המתבטאת בהעדר עצבוב של קטעי מעי באורכים שונים. MEN2B מתאפיין ע"י הופעת גידולים מסוג MTC ו- PHEO בגיל צעיר וסימני היכר נוספים כגון ניורומות בריריות חלל הפה, שפתיים, לשון והעפעפיים, פתולוגיה בעצבוב המעיים (ganglioneuromatosis) ושינויים אופייניים במבנה השלד marfanoid habitus) [ראה 1-3 ]. כל הצורות של התסמונת נגרמות ע"י מוטציות בגן RET.

הפרוטו-אונקוגן RET בודד בסוף שנות ה- 80 בעקבות גילויו כגורם מסרטן בניסוי טרנספקציה. מכאן נגזר גם שמו:

 RET-rearranged during transfection. הגן RET מקודד לקולטן חוצה-ממברנה ממשפחת הטירוזין קינזות tyrosine kinase -TK.  לקולטן זה תפקיד מרכזי בהעברת אותות מהסביבה אל תוך התא, אותות המהווים חלק ממנגנוני הבקרה על הצמיחה, קצב החלוקה, המוות המתוכנן והנדידה של תאים שונים. הגן RET מתבטא ברקמות שונות בעובר ובחייה הבוגרת. בין התאים המבטאים את הגן נמנים תאי ה-C מפרישי הקלציטונין שבליבת בלוטת המגן, תאי הכרומפין ביותרת הכליה המפרישים כטכולאמינים ותאי עצב של מערכת העיכול. לתאים אלו מקור עוברי משותף בתאי-אב של ה- neural crest. בסוף שנות ה-90 תחילת שנות ה-2000 התגלו ארבעה ליגנדים בני אותה משפחה, המפעילים את קולטן ה-RET :

1. GDNF (או: glial cell derived neurotrophic factor)
2. NTN (או: neurturin)
3. PSP (או: persephin)
4. Artemin

קישור הליגנדים לקולטן נעשה בתווכם של ארבעה קו-רצפטורים GFRα 1, 2, 3, 4 בני משפחת ה- GDNF receptor α. לכל ליגנד העדפה לאחד מארבעת הקו-רצפטורים. קישור הליגנד לקומפלקס  -RET GFRα גורם להתקבצות (oligomerization) הקולטנים על פני הממברנה וזרחון עצמוני של שיירי טירוזין במתחם ה-TK, התוך תאי, של חלבון ה-RET. לגן RET שתי צורות של RNA שליח  (ISO 9, ISO 50) המקודדים לקולטנים בעלי מתחם תוך תאי באורכים שונים וכתוצאה מכך בעלי מספר שונה של אתרי זרחון. נראה כי רקמות שונות, בזמני התפתחות שונים, מאופיינות ע"י איזופורמים שונים. לאור התפוצה הרבה של קולטן ה- RET, מרכזיותו בתפקוד תאים שונים בזמן ההתפתחות העוברית ובחיים הבוגרים ולאור מורכבות מנגנוני הוויסות של פעילותו, לא מפליא שמוטציות בגן זה גורמות לפתולוגיות מסוגים שונים.

באופן כללי ניתן לסווג את המוטציות בגן RET למוטציות המבטלות פעילות (loss of function) או  כאלה המשנות את אופי הפעילות (gain of function) של הקולטן. מוטציות הגורמות לחוסר ביטוי של הקולטן על פני הממברנה או ביטוי של קולטן לא פעיל, מפוזרות על פני הגן כולו וגורמות למחלת HSCR שלא כחלק מתסמונת MEN2. מוטציות אלה לא תדונה בסקירה הנוכחית. את המוטציות הגורמות לצורות השונות של התסמונת MEN2 ניתן לסווג ל-4 קטגוריות שונות בהתאם למנגנון פעולתן [2]: א) מוטציות (באקסונים 15 ו-16) המשנות את האפיניות של ה- TK לסובסטרטים הטבעיים וסובסטרטים זרים. מוטציות אלה גורמות לתסמונת  MEN2B. ב) מוטציות בשארי ציסטאין במתחם החוץ תאי של הקולטן (אקסונים 8, 10, 11) הגורמות לצימוד ספונטני, וע"י כך הפעלה בלתי מבוקרת (constitutive activation) של הקולטן. מוטציות אלה גורמות לצורות FMTC ו-MEN2A  של התסמונת. ג) למוטציות בשיירי הציסטאין באקסון 10 יכול להיות ביטוי נוסף דהיינו מחלת HSCR [ראה: 9]. זאת משום שהמוטציות הנ"ל גורמות, מצד אחד, לביטוי מופחת של הקולטן על פני הממברנה ומצד שני הקולטנים המתבטאים הם אונקוגניים. ד) מוטציות באיזורים שונים של המתחם התוך תאי (אקסונים 13-16) שמנגנון פעולתן אינו נהיר דיו. מוטציות אלה גורמות לרוב ל-FMTC אך לעיתים גם ל-MEN2A ול-MEN2B [ראה 5]. בטבלה 1 מסוכמות כל סוגי המוטציות שדווחו עד היום.

בדיקת מוטציות ככלי עזר  באבחון, בטיפול ובמעקב

המידע על המתאם הקיים בין סוגי המוטציות השונות בגן RET לפנוטיפ הצפוי (ראה טבלה) יכול לשמש את הקלינאי במספר אופנים. הפנוטיפ ו/או הסיפור המשפחתי של המחלה יכולים לכוון את הקלינאי להיקף הבדיקות הגנטיות שיש לבצע ואילו סוג המוטציה שימצא יכול לעזור בבחירת הדרכים המיטביות לטיפול ומעקב.

את מי צריך לבדוק ולאיזה מוטציות?

הקונצנזוס היום הוא שיש לבדוק מוטציות בגן RET  אצל כל חולה עם MTC, PHEO, או HSCR (לא סינדרומי)  בין עם הוא מקרה בודד או בעל סיפור משפחתי של המחלה לצורותיו השונים, על מנת לאשר או לשלול תסמונת MEN2. מקרים בודדים של MTC, PHEO או MEN2A יש לבדוק למוטציות בכל 7 האקסונים (8, 10, 11, 13-16) בהן דווחו מוטציות. במקרה של HSCR, עד כמה שידוע לנו עד היום, מספיק לבדוק מוטציות באקסון 10 על מנת לאשר או לשלול תסמונת MEN2. במקרה של MEN2B אפשר להסתפק בבדיקת המוטציה קלאסית, Met918Thr, באקסון 16. במקרה והתשובה היא שלילית יש להמשיך ולבדוק מוטציות נוספות באקסונים 14-16. לאחר מציאת מוטציה אצל המקרה הראשון במשפחה, יש לבדוק את כל הילדים כמו גם בני משפחה נוספים (הורים, אחים, בני דודים וכ"ו) העלולים להיות בסיכון גבוה לפתח מחלה ו/או להעביר את המוטציה לדורות הבאים. ההחלטה באיזה גיל לבדוק את הילדים תלויה בטיב המוטציה שהתגלתה במשפחה והדחיפות של פעולות המניעה שיש לנקוט לגבי הנשאים. יש לציין כי רק בחלק קטן (1-7%) של המקרים הלא-משפחתיים תמצא מוטציה, ואז נשאלת השאלה הבאה?

מה המשמעות של אי-מציאת מוטציה?

מה הסיכוי שלמרות שלא נמצאה מוטציה מדובר במחלה תורשתית? הנתונים העומדים לרשותנו היום מראים כי במרבית ( יותר מ- 98%)  חולי MEN2  נמצאו מוטציות בגן RET באתרים המתוארים בטבלה. במקרים בהם לא נמצאה מוטציה אך תולדות המחלה מצביעים על אפשרות של מחלה תורשתית (גיל הופעה צעיר, גידול דו צדדי או מולטי-פוקלי, גידולים שונים אצל אותו הפרט או מחלה משפחתית) רצוי לבדוק את כל 22 האקסונים של הגן  RET כדי לחפש מוטציות שטרם תוארו. חישובים המתבססים על התיאוריה הבאסינית (Bayesian theory) מראים כי הסיכוי של מחלה תורשתית אצל מקרה בודד של MTC  שלא נמצאה אצלו מוטציה בגן RET, הוא פחות מ- 0.2% [1].

באיזה גיל לבצע ניתוח MTC מניעתי?

קיים קשר, אם כי לא חד ערכי, בין סוג המוטציה והאגרסיביות של גידול ה-MTC. לכן, יש להתייחס לסוג המוטציה כאשר מתכננים ניתוח מניעתי אצל נושאי מוטציה, בטרם הופעת סימנים קליניים או ביוכימיים של המחלה. אצל ילדים עם מוטציות הקשורות לתסמונת MEN2B מומלץ לבצע את הניתוח לפני גיל 6 חודשים ועדיף אפילו לפני גיל חודש. אצל ילדים שאצלם נתגלו מוטציות באקסונים 10 ו- 11 (קודונים 611, 618, 620 ו- 634 ) מומלץ לבצע את הניתוח לפני גיל 5 שנים. לגבי ילדים אצלם נמצאו מוטציות בקודונים 609, 768, 790, 791, 804 ו-891 הדעות חלוקות. יש הממליצים ניתוח לפני גיל 5  שנים, יש הממליצים ניתוח בסביבות גיל 10 שנים, ואחרים ממליצים על מעקב באמצעות בדיקת הפרשת קלציטונין לאחר גירוי עם פנטגסטרין וניתוח רק כאשר התוצאה היא חיובית. כיון שקיים קשר בין מסת הגידול והפרשת קלציטונין יש להשתמש בבדיקה זו בעיקר למעקב לנוכחות MTC ו/או גרורות לפני ואחרי הניתוח.

תדירות המעקב ל-PHEO, HPT ו-HSCR

הופעת PHEO נצפתה במשפחות עם כמעט כל המוטציות בגן RET שתוארו עד כה (ראה טבלה), אך ההדירות שונה לגבי המוטציות השונות. בפרטים עם מוטציות הקשורות בתסמונת MEN2B  או מוטציות בקודון 634, הסיכון ל- PHEO הוא 50%, בפרטים עם מוטציות באקסון 10 הוא בסביבות 8% ואילו בנשאי שאר המוטציות הוא נמוך יותר. כיוון שבנשאי מוטציות בקודון 634 נתגלו מקרים עם  PHEO כבר בגיל מאד צעיר (5-10 שנים), בנשאים של מוטציות אלה מומלץ מעקב ביוכימי שנתי ומעקב הדמיתי כל 3-5 שנים. בכל מקרה, בתכנון בדיקות המעקב יש להתייחס גם לתולדות המחלה במשפחה.

 הופעת HPT קשורה גם כן בעיקר למוטציות בקודון 634. יש לבדוק רמת PTH וקלציום יוני בסרום כל 2-3 שנים, או יותר תדיר במשפחות עם מקרים מתועדים של HPT. ככלל, חולי MEN2B אינם מפתחים HPT.

במשפחות עם מוטציות בשארי ציסטאין בקודון 10, יש לשים לב לאפשרות של מחלת  HSCR אצל ילודים וגם אצל מבוגרים. במקרה של גילוי או חשד ל- HSCR יש לבצע בדיקת מוטציות באקסון 10 כדי לאשר או לשלול תסמונת MEN2.

יעוץ גנטי

מתן יעוץ גנטי לפני ואחרי ביצוע בדיקות גנטיות הוא חובה. הייעוץ יכול להינתן ע"י הרופא המטפל, במידה והוא מצוי בטכניקות של יעוץ גנטי, או ע"י יועצים גנטיים המתמחים בתחום של מחלות סרטן תורשתיות.

סיכום

על בסיס הידע המדעי והקליני שהצטבר בשנים האחרונות, קיימת המלצה לבדוק כל חולה עם MTC, PHEO, או HSCR למוטציות בגן RET על מנת לאשר או לשלול תסמונת MEN2. קיים קשר בין סוגי המוטציות וחומרת וצורות הביטוי של התסמונת ולכן, סוג המוטציה שנמצאה, יכול לכוון את האבחון, הטיפול והמעקב בחולה ובמשפחתו. 90% מהמטופלים אצלם התגלתה המחלה בשלב מוקדם עקב סקירה משפחתית, נשארו חופשיים ממחלה! אצל חולים שאצלם לא נמצאה מוטציה בגן RET, הסיכוי שהמחלה היא תורשתית הוא נמוך ביותר (בערך 0.2%). בדיקת מוטציות בגן RET לא רק משפרת את הטיפול בחולה ובבני משפחתו אך גם חוסכת הוצאות למערכת הבריאות [7]. בנוסף, הבנת הבסיס המולקולרי של התסמונת פותח פתח לגישות טיפוליות חדשניות [8].

מובאות:

1. Brandi ML, Gagel RF, Angeli A, Bilezikian JP, Beck-Peccoz P, Bordi C, Conte-Devolx B, Falchetti A,  Gheri RG, Libroia A, Lips CJM, Lombaedi G, Mannelli M, Pacini F, Ponder BAJ, Raue F, Skogseid B, Tamburrano G, Thakker RV, Thompson NW, Tomassetti P, Tonelli F, Wells SA Jr, Marx SJ (2001). Consensus guidelines for diagnosis and therapy of MEN type 1 and type 2. J Clin Endocrinol Metab 86: 5658-5671.

2. Alberti L, Carniti C, Miranda C, Roccato E, Pierroti MA (2003). RET and NTRK1 Proto-Oncogenes in Human Diseases. J Cell Physiol 195: 168-186.

3. Leboulleux S, Baudin E, Travagly J-P, Schlumberger M (2004). Medullary thyroid carcinoma. Clin Endocrinol 61:299-310.

4. Kameyama K, Okinaga H, Takami H (2004). RET oncogene mutations in 75 cases of familial medullary thyroid carcinoma in Japan. Biomedicine & Pharmacotherapy 58: 345-347.

5. Jimenez C, Habra MA, Huang S-C E, El-Naggar A, Shapiro SE, Evans DB, Cote G, Gagel RF (2004). Pheochromocytoma and medullary thyroid carcinoma: a new genotype-phenotype correlation of the RET protooncogene 891 germline mutation. . J Clin Endocrinol Metab 89: 4142-4145.

6. Jimenez C, Dang GT, Schultx PN, El-Naggar A, Shapiro S, Barnes EA, Evans DB, Vassiloopoulou-Sellin R, Gagel RF, Cote GJ, Hoff AO (2004). A novel point mutation of the RET protooncogene involving the second intracellular tyrosine kinase domain in a family with medullary thyroid carcinoma. . J Clin Endocrinol Metab 89: 3521-3526.

7. Gilchrist DM, Morrish DW, Bridge PJ, Brown JL (2004). Cost analysis of DNA-based testing in a large Canadian family with multiple endocrine neoplasia type 2. Clin Genet 66: 349-352.

8. Drosten M, Hilken G, Bockmann M, Rodicker F, Mise N, Cranston AN, Dahmen U, Ponder BA, Putzer BM (2004). Role of MEN2A-derived RET in maintenance and proliferation of medullary thyroid carcinoma. J Natl Cancer Inst 96: 1231-1239.

9. Peretz H, Luboshitsky R, Baron E, Biton A, Gershoni R, Usher S, Grynberg E, Yakobson E, Graff E, Lapidot M (1997). Cys 618 Arg mutation in the RET proto-oncogene associated with familial medullary thyroid carcinoma and maternally transmited Hirschsprung's disease suggesting a role for imprinting. Human Mutation 10: 155-159.

טבלה 1: מתאם בין מוטציות בגן RET ומופע קליני:

מיקום מוטציה
אקסון	ח' אמינית	מופע קליני
8	Gly 533 532ins[Glu-Glu-Cys]	MTC MTC
10	Lys 603 Cys 609 Cys 611 Cys 618 Cys 620	MTC, PTC MTC, MEN2A, HSCR MTC, MEN2A, HSCR MTC, MEN2A, HSCR MTC, MEN2A, HSCR
11	Cys 630 Glu 632 + Leu 633 Cys 634 Cys 634 + Ala 640 635ins[His-Glu-Leu-Cys] 637ins[Cys-Arg-Thr]	MTC, MEN2A MTC MTC, MEN2A MEN2A MEN2A MEN2A
13	Glu 768 Leu 790 Tyr 791	MTC MTC, MEN2A, PTC MTC, PTC
14	Val 804 Val 804 + Val 778 Val 804 + Tyr 806ref 4	MTC, MEN2A, PTC MTC MEN2B
14+15 15	Val804+Ser904 Ala 883 Ser 891	MEN2B atypical MEN2B MTC, MEN2A ref 5
16	Arg 912 ref 6 Met 918	MTC MEN2B

 מאת דר' חוה פרץ, המעבדה לביוכימיה קלינית, מרכז רפואי ע"ש סורסקי, תל אביב; hperetz@tasmc.health.gov.il